Kit rápido de mutaxénese dirixido polo sitio

Mutación rápida nun só sitio ou en varios sitios no xene diana do vector diana.

A mutaxénese in vitro dirixida ao sitio é un importante método experimental en varios campos da bioloxía e a medicina, que se emprega principalmente para modificar e optimizar xenes diana, explorar os sitios reguladores dos promotores, así como estudar a complexa relación entre a estrutura e a función das proteínas. O kit adopta a tecnoloxía líder actual para levar a cabo directamente unha mutación nun só sitio, mutación en varios sitios, así como mutación por inserción ou supresión no xene diana. A taxa de mutación da mutación dun sitio pode chegar a máis do 90%. Ademais, a diferenza dos kits de mutación tradicionais que requiren varias roldas de PCR, subclonación e outros pasos que consumen moito tempo e traballo, o funcionamento do kit é máis sinxelo e só son necesarios catro pasos para construír a cepa mutante.

Cat. Non Tamaño do envase
44992901 20 rxn

 

 


Detalle do produto

FAQ

Etiquetas do produto

características

■ Sinxelo e rápido: o kit adopta tecnoloxía de amplificación de plásmidos sen substitución de cadeas. Só precisa 4 pasos para realizar a transformación de cepa de tipo salvaxe a cepa mutante, sen os pasos que consumen tempo e traballo, como varias roldas de PCR e sub-clonación.
■ Imprimación de alta eficiencia: o kit adopta o principio do deseño de imprimación parcialmente solapado, de xeito que se poden obter máis plásmidos mutantes mediante amplificación.
■ Amplamente aplicable: o kit non só pode levar a cabo unha mutación nun só sitio, senón tamén unha mutación en varios sitios. Pode mutar ata 5 sitios.
■ Forte adaptabilidade: o kit pode realizar mutacións dirixidas ao sitio en plásmidos cun tamaño máximo de 10 kb, cubrindo basicamente todos os plásmidos de uso común.
■ Alta taxa de mutación: o kit ten a función de dobre dixestión de modelos de plásmidos metilados in vitro e in vivo, asegurando unha maior taxa de mutación.

Configuración da reacción de mutación do sitio e programa de PCR

■ Para a mutación multi-sitio de cebador único, a taxa de mutación será inferior á da mutación dun sitio debido ao aumento do número de sitios de mutación. Segundo os nosos datos experimentais, cando o número de sitios de mutación alcance 5, a taxa de mutación positiva reducirase ao 50%. Polo tanto, neste caso, recoméndase aumentar o número de clons verificados.
■ O kit admite a mutación multi-cebador multi-sitio, de xeito que os experimentos de mutación poden realizarse simultaneamente nunha gama máis ampla de xenes. O límite superior do número de sitios de mutación aínda é 5.
■ Suxírese que os plásmidos e cebadores de control subministrados no kit se apliquen ao realizar novos experimentos de mutación para facilitar a análise de problemas experimentais.

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

Todos os produtos pódense personalizar para ODM / OEM. Para máis detalles,faga clic en Servizo personalizado (ODM / OEM)


  • Anterior:
  • Seguinte:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    P: Non hai bandas de amplificación

    Modelo A-1

    ■ O modelo contén impurezas de proteínas ou inhibidores de Taq, etc. —Purificar o modelo de ADN, eliminar as impurezas de proteínas ou extraer o ADN modelo con kits de purificación.

    ■ A desnaturalización do modelo non está completa - Aumentar adecuadamente a temperatura de desnaturalización e prolongar o tempo de desnaturalización.

    ■ Degradación do modelo: prepara de novo o modelo.

    Imprimación A-2

    ■ Mala calidade dos cebadores ——Resintetiza o cebador.

    ■ Degradación de imprimación ——Aliquot os cebadores de alta concentración en pequeno volume para a súa conservación. Evite a conxelación e desconxelación múltiple ou crioconservación a longo prazo de 4 ° C.

    ■ Deseño inadecuado dos cebadores (por exemplo, a lonxitude do cebador non é suficiente, o dímero formado entre os cebadores, etc.).

    A-3 Mg2+concentración

    ■ Mg2+ a concentración é demasiado baixa —— Aumentar adecuadamente Mg2+ concentración: Optimizar o Mg2+ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo2+ concentración para cada modelo e cartilla.

    A-4 Temperatura de recocido

    ■ A alta temperatura de recocido afecta á unión da imprimación e do molde. ——Reducir a temperatura de recocido e optimizar o estado cun gradiente de 2 ° C.

    A-5 Tempo de ampliación

    ■ Tempo de extensión curto —— Aumentar o tempo de extensión.

    P: Falso positivo

    Fenómenos: as mostras negativas tamén mostran as bandas de secuencia obxectivo.

    A-1 Contaminación de PCR

    ■ Contaminación cruzada de produtos de amplificación ou de secuencia diana ——Para non pipetar con precaución a mostra que contén a secuencia diana na mostra negativa nin derramalos fóra do tubo da centrífuga. Os reactivos ou equipos deben ser autoclavados para eliminar os ácidos nucleicos existentes e a existencia de contaminación debe determinarse mediante experimentos de control negativo.

    ■ Contaminación dos reactivos ——Aliquote os reactivos e almacénelos a baixa temperatura.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ a concentración é demasiado baixa —— Aumentar adecuadamente Mg2+ concentración: Optimizar o Mg2+ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo2+ concentración para cada modelo e cartilla.

    ■ Deseño de cebador incorrecto e a secuencia diana ten homoloxía coa secuencia non diana. —— Cebadores de redeseño.

    P: Amplificación non específica

    Fenómenos: as bandas de amplificación de PCR son incompatibles co tamaño esperado, grande ou pequeno, ou ás veces prodúcense ambas bandas de amplificación específicas e bandas de amplificación non específicas.

    A-1 Imprimación

    ■ Mala especificidade da imprimación

    —— Imprimación de redeseño.

    ■ A concentración de imprimación é demasiado elevada —— Aumenta adecuadamente a temperatura de desnaturalización e prolonga o tempo de desnaturalización.

    A-2 Mg2+ concentración

    ■ O Mg2+ a concentración é demasiado alta ——Reducir adecuadamente a concentración de Mg2 +: Optimizar o Mg2+ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo2+ concentración para cada modelo e cartilla.

    A-3 Polimerase termoestable

    ■ Cantidade excesiva de encima ——Reducir a cantidade de enzima adecuadamente a intervalos de 0,5 U.

    A-4 Temperatura de recocido

    ■ A temperatura de recocido é demasiado baixa: aumenta axeitadamente a temperatura de recocido ou adopta o método de recocido en dúas etapas.

    A-5 ciclos de PCR

    ■ Demasiados ciclos de PCR ——Reducir o número de ciclos de PCR.

    P: Bandas irregulares ou manchas

    A-1 Imprimación——Pobre especificidade ——Deseña de novo a imprimación, cambie a posición e a lonxitude da imprimación para mellorar a súa especificidade; ou realizar PCR aniñada.

    Modelo ADN A-2

    ——A plantilla non é pura ——Purifica a plantilla ou extrae ADN con kits de purificación.

    A-3 Mg2+ concentración

    ——Mg2+ a concentración é demasiado alta ——Reducir adecuadamente Mg2+ concentración: Optimizar o Mg2+ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo2+ concentración para cada modelo e cartilla.

    A-4 dNTP

    ——A concentración de dNTP é demasiado alta ——Reduce a concentración de dNTP adecuadamente

    A-5 Temperatura de recocido

    ——Temperatura de recocido demasiado baixa—— Aumentar adecuadamente a temperatura de recocido

    Ciclos A-6

    ——Moitos ciclos ——Optimiza o número de ciclos

    P: Canto ADN modelo debe engadirse nun sistema de reacción de PCR de 50 μl?
    ytry
    P: Como amplificar fragmentos longos?

    O primeiro paso é escoller a polimerase axeitada. A polimerase Taq regular non pode revisarse debido á falta de actividade de exonucleasa 3'-5 ', e o desaxuste reducirá moito a eficiencia de extensión dos fragmentos. Polo tanto, a polimerase Taq regular non pode amplificar con eficacia fragmentos diana maiores a 5 kb. A taq polimerase con modificación especial ou outra polimerase de alta fidelidade debe seleccionarse para mellorar a eficiencia da extensión e satisfacer as necesidades de amplificación de fragmentos longos. Ademais, a amplificación de fragmentos longos tamén require un axuste correspondente do deseño da imprimación, o tempo de desnaturalización, o tempo de extensión, o pH do tampón, etc. Normalmente, os imprimadores con 18-24 pb poden levar a un mellor rendemento. Para evitar danos na plantilla, o tempo de desnaturalización a 94 ° C debería reducirse a 30 segundos ou menos por ciclo e o tempo para subir a temperatura a 94 ° C antes da amplificación debería ser inferior a 1 min. Ademais, establecer a temperatura de extensión a uns 68 ° C e deseñar o tempo de extensión segundo a velocidade de 1 kb / min pode garantir unha amplificación efectiva de fragmentos longos.

    P: Como mellorar a fidelidade de amplificación da PCR?

    A taxa de erro da amplificación por PCR pode reducirse empregando varias ADN polimerasas con alta fidelidade. Entre todas as ADN polimerases de Taq atopadas ata o momento, o encima Pfu ten a taxa de erro máis baixa e a fidelidade máis alta (ver táboa adxunta). Ademais da selección de encimas, os investigadores poden reducir aínda máis a taxa de mutación da PCR optimizando as condicións de reacción, incluíndo a composición do tampón, a concentración de polimerase termoestable e o número de ciclos de PCR.

    Escribe aquí a túa mensaxe e mándana