Kit FastKing RT (con gDNase)

O ARN A-1 é degradado

——Purificar o ARN de alta calidade sen contaminación. O material do que se extrae o ARN debe ser o máis fresco posible para evitar a degradación do ARN. Analiza a integridade do ARN nun xel desnaturalizado antes da reacción RT. Despois da extracción de ARN, debe almacenarse en formamida ao 100%. Se se usa un inhibidor da RNase, a temperatura de calefacción debe ser inferior a 45 ° C e o pH debe ser inferior a 8,0, se non, o inhibidor liberará toda a RNase unida. Ademais, o inhibidor da RNase debe engadirse a solucións que conteñan TDT ≥ 0,8 mM.

O ARN A-2 contén inhibidores das reaccións de transcrición inversa

—— Os inhibidores da transcrición inversa inclúen SDS, EDTA, glicerol, pirofosfato de sodio, espermidina, formamida, sal de guanidina, etc. Mestura o ARN control coa mostra e compara o rendemento coa reacción de ARN control para comprobar se hai un inhibidor. Lavar a precipitación de ARN cun etanol ao 70% (v / v) para eliminar os inhibidores.

A-3 Recocimento insuficiente de cebadores usados ​​para sintetizar a primeira cadea de ADNc

—— Determinar que a temperatura de recocido é adecuada para os cebadores utilizados no experimento. Para hexámeros aleatorios, recoméndase manter a temperatura a 25 ° C durante 10 minutos antes de alcanzar a temperatura de reacción. Para cebadores específicos de xenes (GSP), proba con outros GSP ou cambia a oligo (dT) ou hexámero aleatorio.

A-4 Pequena cantidade de ARN inicial

——Aumentar a cantidade de ARN. Para mostras de ARN de menos de 50 ng, pódese empregar 0,1 μg a 0,5 μg de acetilo BSA na primeira síntese de ADNc de cadea

A-5 A secuencia diana non se expresa nos tecidos analizados.

——Proba outros tecidos.

A reacción da PCR A-6 falla

——Para RT-PCR en dous pasos, o modelo de ADNc no paso PCR non pode superar 1/5 do volume de reacción.

A-1 Recocido non específico de cebadores e plantillas

—— O extremo 3 'dos ​​cebadores non debe conter 2-3 dG ou dC. Use cebadores específicos de xenes na primeira síntese de cadeas en lugar de cebadores aleatorios ou oligo (dT). Empregue unha temperatura de recocido máis alta nos primeiros ciclos e logo unha temperatura de recocimento máis baixa. Use a ADN polimerase Taq de inicio quente para PCR para mellorar a especificidade da reacción.

A-2 Pobre deseño de cebadores específicos de xenes

——Siga os mesmos principios para o deseño de imprimación de amplificación.

ARN A-3 contaminado con ADN xenómico

——Tratar ARN con DNase PCR de grao I. Configure unha reacción de control sen transcrición inversa para detectar a contaminación do ADN.

A-4 Formación do dímero de imprimación

——Deseñar cebadores sen secuencias complementarias no extremo 3 '.

A-5 Mg moi alto²⁺ concentración

——Optimize Mg²⁺ concentración para cada combinación de modelo e imprimación

A-6 Contaminado con ADN alleo

—— Use puntas resistentes aos aerosois e encimas UDG.

A-1 O contido do primeiro produto de cadea é demasiado alto

——Reducir a cantidade do produto da primeira cadea na etapa de reacción PCR convencional.

A-2 Cantidade de imprimación demasiado alta na reacción de PCR

——Reducir a entrada de imprimación.

A-3 Demasiados ciclos

——Optimize condicións de reacción PCR e reducir o número de ciclo de PCR.

A-4 Temperatura de recocido demasiado baixa

—— Aumentar a temperatura de recocido para evitar iniciación e extensión non específicas.

A-5 Amplificación non específica de fragmentos de oligonucleótidos xerados pola degradación da ADNase por DNase: extrae ARN de alta calidade para evitar a contaminación do ADN.

RT-PCR consiste en transcribir inversamente o ARN en ADNc e despois usar o ADNc transcrito inversamente como modelo para a reacción da PCR para amplificar o fragmento diana. Escolla cebadores aleatorios, Oligo dT e cebadores específicos de xenes segundo as condicións específicas do experimento. Todos os cebadores anteriores poden usarse para o ARNm de células eucariotas curtas sen estrutura de horquilla.

Imprimación aleatoria: Adecuado para ARN longo con estrutura de horquilla, así como para todo tipo de ARN como ARNr, ARNm, ARNt, etc. Utilízanse principalmente para a reacción RT-PCR dun único molde.

Oligo dT: Adecuado para o ARN con cola PolyA (o ARN procariota, o ARNc e Oligo dT e ARC ARN eucariota non teñen colas PolyA). Debido a que Oligo dT está unido á cola PolyA, é necesario que a calidade das mostras de ARN sexa alta e incluso unha pequena cantidade de degradación reducirá moito a cantidade de síntese de ADNc de lonxitude completa.

Imprimación xenética: Complementaria á secuencia modelo, adecuada para situacións nas que se coñece a secuencia diana.

Hai dous xeitos:

1. Método de referencia interna: en teoría, o ADNc é fragmentos de ADN de diferentes lonxitudes, polo que o resultado da electroforese é o frotis. Se a abundancia de ARN é baixa, ningún produto aparecerá na electroforese, pero isto non significa que ningún produto se amplifique mediante PCR. En xeral, pódese usar referencia interna para detectar ADNc. Se a referencia interna ten resultados, pódese garantir basicamente a calidade do ADNc (nalgúns casos, se o fragmento do xene diana é demasiado longo, pode haber excepcións).

2. Se hai un xene coñecido amplificado por este modelo, pódese comprobar cos cebadores deste xene. A amplificación da referencia interna non significa necesariamente que non haxa ningún problema co ADNc. Debido a que a referencia interna ten unha gran abundancia en ADNc, é fácil de amplificar. Se o ADNc está parcialmente degradado por varias razóns, desde a perspectiva da probabilidade, os resultados da PCR de xenes diana de baixa abundancia veranse moi afectados. Aínda que a referencia interna segue sendo abundante, a amplificación probablemente non se verá afectada.

Degradar parcialmente o ARN. Detectar a integridade e purificar o ARN

O contido de ARN de distintas especies pode ser diferente, pero en xeral, o ARN total extraído debe conter dúas bandas claras 28S e 18S en electroforese en xel e o brillo da banda anterior debería ser o dobre que o da segunda. A banda 5S indica que o ARN se degradou e que o seu brillo é proporcional ao grao de degradación. A amplificación exitosa da referencia interna non significa que non haxa ningún problema co ARN, porque a referencia interna é moi abundante, o ARN pode amplificarse sempre que a degradación non sexa grave. O OD₂₆₀/ OD₂₈₀a proporción de ARN puro medida por espectrofotómetro debe estar entre 1,9 e 2,1. Unha pequena cantidade de impureza de proteínas no ARN reducirá a proporción. Mentres o valor non sexa demasiado baixo, a RT non se verá afectada. O que máis importa para RT é a integridade do ARN.

A extensión do xene de referencia interno só pode indicar que RT tivo éxito, pero non necesariamente está relacionado coa calidade da cadea de ADNc. Debido a que os fragmentos de referencia interna son xeralmente de pequeno tamaño e de alta expresión, son máis fáciles de ter éxito na transcrición inversa. Non obstante, o tamaño e a expresión do xene diana varía dun xene a outro. A calidade do ADNc non se pode xulgar só por referencia interna, especialmente para os fragmentos diana de máis de 2 kb.

Algunhas mostras teñen estruturas secundarias complexas ou teñen un contido rico en GC ou son preciosas con pouca abundancia. Nestes casos, debería seleccionarse a transcriptase inversa adecuada segundo o tamaño do fragmento obxectivo e da mostra. Para as plantillas de ARN con alto contido de GC e estrutura secundaria complexa, é difícil abrir a estrutura secundaria a baixa temperatura ou cunha transcritase inversa común. Para estes modelos, pódese seleccionar Quant Reverse Transcriptase, xa que o seu rendemento de transcrición inversa é obviamente mellor que o da transcriptase inversa da serie M-MLV, que pode transcribir de forma eficiente varios modelos de ARN de xeito eficiente e transcribir o ARN na primeira cadea de ADNc na medida máxima. Cando se usa un kit de transcritase inversa xeral, o sistema de 20 μl só pode transcribir de forma efectiva 1 μg de ARN total. Preste atención á capacidade máxima do kit RT. Se o modelo se engade en exceso, a transcrición inversa favorecerá o ARN con abundancia. Polo tanto, é mellor non superar a capacidade máxima do sistema.

A-1 Determine se o ARN se degrada severamente e se o RT ten éxito

En xeral, a razón do fracaso da amplificación de referencia interna adoita ser causada por unha grave degradación do ARN. Outro motivo posible é o fallo da transcrición inversa. A referencia interna non se pode usar como estándar para xulgar a calidade da cadea única de ADNc, pero pode usarse como estándar para xulgar se a transcrición inversa ten éxito se non hai ningún problema de calidade do ARN. O máis importante no proceso de transcrición inversa é manter unha temperatura constante e un sistema de reacción constante para mellorar a eficiencia da reacción.

A-2 Determine se os cebadores para amplificar xenes de referencia internos son fiables e se hai algún problema cos reactivos empregados na PCR.

Para a cuantificación relativa, o ARN debe cuantificarse antes da transcrición inversa, o que tamén é necesario en moitos kits de transcrición inversa, por exemplo, cuantificar a entrada de ARN como 1 μg. Dado que o ADNc transcrito inversamente é unha solución mixta, incluíndo ARN, oligo dT, encima, dNTP e incluso un pouco de residuo de ADN, producirase desviación, polo que é imposible cuantificar con precisión o ADNc. Polo tanto, é necesaria a cuantificación do ARN. Considerando que a eficiencia da transcrición inversa é a mesma entre as distintas mostras, a cantidade de ADNc obtida debería ser a mesma e a análise cuantitativa pode amosar a comparación dos niveis de expresión de diferentes xenes na mesma cantidade de ARN total. Ao realizar PCR cuantitativa de fluorescencia relativa, é posible que non se precise un ADNc cuantitativo despois da transcrición inversa porque o xene de referencia interno pode actuar como referencia.

Está relacionado principalmente cos xenes e a transcrición inversa do fragmento longo non é factible para a maioría dos xenes. En primeiro lugar, a eficiencia da transcrición inversa é moi inferior á da PCR. En segundo lugar, a rexión rica en GC e a estrutura secundaria de moitos xenes restrinxen a transcrición inversa e a PCR. Finalmente, a fidelidade e a eficiencia de amplificación da PCR son difíciles de garantir ao mesmo tempo. No proceso de transcrición inversa, ninguén pode garantir a obtención de fragmentos longos para xenes con pouca copia, especialmente usando oligo dT. En canto ao 5 'UTR con máis GC, é aínda máis difícil. Polo tanto, aínda é un método razoable para inverter a transcrición con cebadores aleatorios, atopar os sitios de escisión naturais no fragmento diana, amplificar por segmentos e despois realizar a dixestión e ligadura de restrición. En xeral, é difícil amplificar directamente fragmentos de máis de 2 kb, pero non sempre é imposible obter: 1. En primeiro lugar, garantir a integridade do ARN / ARNm e prefírese a extracción de TRIZOL. 2. Pódese usar directamente o kit M-MLV RT-PCR. Amplíe o tempo de recocido e aumente o número de ciclos no proceso de amplificación correctamente. Alternativamente, pódese aplicar PCR aniñada ou realizar unha ou dúas reaccións primeiro cunha desnaturalización e tempo de extensión adecuadamente estendidos antes da amplificación normal de PCR, o que pode axudar a estender fragmentos. Preste atención á fidelidade da polimerase. 3. Long Taq pode usarse en PCR para obter resultados ideais. 4. Para a aplicación de expresión de proteínas, debería aplicarse a polimerase de alta fidelidade.

TIANGEN ofrece dous tipos de transcritasa inversa: Quant / King RTase e TIANScript M-MLV. A principal diferenza entre eles é a cantidade de entrada de modelos. Quant é unha transcritase inversa única, que é diferente da M-MLV de uso común derivada do virus da leucemia murina Moloney. Quant é unha nova transcriptase inversa de alta eficiencia expresada de forma recombinante por Enxeñaría Escherichia coli. Quant é adecuado para amplificar 50 ng-2 μg de ARN con alta actividade transcricional inversa e alto rendemento. En comparación con MMLV ou AMV comúns, a característica máis grande de Quant é que ten unha afinidade moi forte cos modelos de ARN e pode revertir modelos complexos de transcrición sen desnaturalizar a altas temperaturas. Para os modelos con maior contido de GC, a eficiencia inversa é maior. Non obstante, esta transcriptase inversa ten actividade RNase H, que pode afectar a lonxitude do produto de ADNc (adecuado para modelos de <4,5 kb). Para a transcrición inversa convencional, recoméndase a transcriptase inversa TIANScript MMLV. Esta RTase é un encima modificado cunha actividade RNase H moi feble, que é adecuado para a síntese de ADNc longa (> 5 kb).

A transcrición inversa dun paso e a amplificación por PCR complétanse no mesmo tubo sen abrir a tapa do tubo entre a síntese de ADNc e a amplificación, o que é útil para reducir a contaminación. Dado que todas as mostras de ADNc obtidas úsanse para a amplificación, a sensibilidade é maior, cun mínimo de 0,01 pg de ARN total. Para un RTPCR dunha etapa con éxito, os cebadores específicos do xene utilízanse xeralmente para iniciar a síntese de ADNc. O método en dous pasos, a saber, a transcrición inversa e a amplificación por PCR lévase a cabo en dous pasos. En primeiro lugar lévase a cabo a transcrición inversa a partir dun molde de ARN para obter ADNc, e o ADNc obtido sométese a unha ou máis reaccións de PCR diferentes. O método en dous pasos pode usar oligo (dT) ou cebadores aleatorios para guiar a síntese da primeira cadea de ADNc e pode transcribir inversamente toda a información de ARNm dunha mostra específica.