2 × Pfu PCR Mix

Modelo A-1

■ O modelo contén impurezas de proteínas ou inhibidores de Taq, etc. —Purificar o modelo de ADN, eliminar as impurezas de proteínas ou extraer o ADN modelo con kits de purificación.

■ A desnaturalización do modelo non está completa - Aumentar adecuadamente a temperatura de desnaturalización e prolongar o tempo de desnaturalización.

■ Degradación do modelo: prepara de novo o modelo.

Imprimación A-2

■ Mala calidade dos cebadores ——Resintetiza o cebador.

■ Degradación de imprimación ——Aliquot os cebadores de alta concentración en pequeno volume para a súa conservación. Evite a conxelación e desconxelación múltiple ou crioconservación a longo prazo de 4 ° C.

■ Deseño inadecuado dos cebadores (por exemplo, a lonxitude do cebador non é suficiente, o dímero formado entre os cebadores, etc.).

A-3 Mg²⁺concentración

■ Mg²⁺ a concentración é demasiado baixa —— Aumentar adecuadamente Mg²⁺ concentración: Optimizar o Mg²⁺ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo²⁺ concentración para cada modelo e cartilla.

A-4 Temperatura de recocido

■ A alta temperatura de recocido afecta á unión da imprimación e do molde. ——Reducir a temperatura de recocido e optimizar o estado cun gradiente de 2 ° C.

A-5 Tempo de ampliación

■ Tempo de extensión curto —— Aumentar o tempo de extensión.

Fenómenos: as mostras negativas tamén mostran as bandas de secuencia obxectivo.

A-1 Contaminación de PCR

■ Contaminación cruzada de produtos de amplificación ou de secuencia diana ——Para non pipetar con precaución a mostra que contén a secuencia diana na mostra negativa nin derramalos fóra do tubo da centrífuga. Os reactivos ou equipos deben ser autoclavados para eliminar os ácidos nucleicos existentes e a existencia de contaminación debe determinarse mediante experimentos de control negativo.

■ Contaminación dos reactivos ——Aliquote os reactivos e almacénelos a baixa temperatura.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ a concentración é demasiado baixa —— Aumentar adecuadamente Mg²⁺ concentración: Optimizar o Mg²⁺ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo²⁺ concentración para cada modelo e cartilla.

■ Deseño de cebador incorrecto e a secuencia diana ten homoloxía coa secuencia non diana. —— Cebadores de redeseño.

Fenómenos: as bandas de amplificación de PCR son incompatibles co tamaño esperado, grande ou pequeno, ou ás veces prodúcense ambas bandas de amplificación específicas e bandas de amplificación non específicas.

A-1 Imprimación

■ Mala especificidade da imprimación

—— Imprimación de redeseño.

■ A concentración de imprimación é demasiado elevada —— Aumenta adecuadamente a temperatura de desnaturalización e prolonga o tempo de desnaturalización.

A-2 Mg²⁺ concentración

■ O Mg²⁺ a concentración é demasiado alta ——Reducir adecuadamente a concentración de Mg2 +: Optimizar o Mg²⁺ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo²⁺ concentración para cada modelo e cartilla.

A-3 Polimerase termoestable

■ Cantidade excesiva de encima ——Reducir a cantidade de enzima adecuadamente a intervalos de 0,5 U.

A-4 Temperatura de recocido

■ A temperatura de recocido é demasiado baixa: aumenta axeitadamente a temperatura de recocido ou adopta o método de recocido en dúas etapas.

A-5 ciclos de PCR

■ Demasiados ciclos de PCR ——Reducir o número de ciclos de PCR.

A-1 Imprimación——Pobre especificidade ——Deseña de novo a imprimación, cambie a posición e a lonxitude da imprimación para mellorar a súa especificidade; ou realizar PCR aniñada.

Modelo ADN A-2

——A plantilla non é pura ——Purifica a plantilla ou extrae ADN con kits de purificación.

A-3 Mg²⁺ concentración

——Mg²⁺ a concentración é demasiado alta ——Reducir adecuadamente Mg²⁺ concentración: Optimizar o Mg²⁺ concentración por unha serie de reaccións de 1 mM a 3 mM cun intervalo de 0,5 mM para determinar o Mg óptimo²⁺ concentración para cada modelo e cartilla.

A-4 dNTP

——A concentración de dNTP é demasiado alta ——Reduce a concentración de dNTP adecuadamente

A-5 Temperatura de recocido

——Temperatura de recocido demasiado baixa—— Aumentar adecuadamente a temperatura de recocido

Ciclos A-6

——Moitos ciclos ——Optimiza o número de ciclos

O primeiro paso é escoller a polimerase axeitada. A polimerase Taq regular non pode revisarse debido á falta de actividade de exonucleasa 3'-5 ', e o desaxuste reducirá moito a eficiencia de extensión dos fragmentos. Polo tanto, a polimerase Taq regular non pode amplificar con eficacia fragmentos diana maiores a 5 kb. A taq polimerase con modificación especial ou outra polimerase de alta fidelidade debe seleccionarse para mellorar a eficiencia da extensión e satisfacer as necesidades de amplificación de fragmentos longos. Ademais, a amplificación de fragmentos longos tamén require un axuste correspondente do deseño da imprimación, o tempo de desnaturalización, o tempo de extensión, o pH do tampón, etc. Normalmente, os imprimadores con 18-24 pb poden levar a un mellor rendemento. Para evitar danos na plantilla, o tempo de desnaturalización a 94 ° C debería reducirse a 30 segundos ou menos por ciclo e o tempo para subir a temperatura a 94 ° C antes da amplificación debería ser inferior a 1 min. Ademais, establecer a temperatura de extensión a uns 68 ° C e deseñar o tempo de extensión segundo a velocidade de 1 kb / min pode garantir unha amplificación efectiva de fragmentos longos.

A taxa de erro da amplificación por PCR pode reducirse empregando varias ADN polimerasas con alta fidelidade. Entre todas as ADN polimerases de Taq atopadas ata o momento, o encima Pfu ten a taxa de erro máis baixa e a fidelidade máis alta (ver táboa adxunta). Ademais da selección de encimas, os investigadores poden reducir aínda máis a taxa de mutación da PCR optimizando as condicións de reacción, incluíndo a composición do tampón, a concentración de polimerase termoestable e o número de ciclos de PCR.